Paquetes de trabajo

Se realizará un proceso exhaustivo de minería de datos y revisión bibliográfica para identificar los principales conocimientos existentes sobre los sistemas de alerta de plagas, el rendimiento del Cu en los suelos de los viñedos, los cultivos de cobertura en los viñedos, la biodiversidad del suelo y los servicios ecosistémicos relacionados, y los modelos de producción de los viñedos. Se revisarán y analizarán los resultados de la literatura científica, los proyectos europeos y nacionales, las bases de datos e informes históricos (incluido el EIP-AGRI).

Los experimentos se llevarán a cabo en dos viñedos:

• Zona Eurosiberiana: parcela experimental en la Estación Fitopatológica de Areeiro (DO Rías Baixas). 0,8 hectáreas a 62 m de altitud. La parcela es prácticamente plana, relativamente aireada y el suelo de textura franco-arenosa. Se plantó en 2008 con vides en espaldera vertical y un marco de plantación de 3 x 2,5 m. Ver geolocalización
• Zona mediterránea: parcela experimental perteneciente a la Cooperativa de bodegas Viña Costeira (DO Ribeiro). 12 hectáreas a 262 m de altitud. La parcela tiene una pendiente del 26%, relativamente aireada, con suelo franco arenoso. Se plantó en 2008 con vides en espaldera vertical y un marco de plantación de 3 x 2,5 m. Ver geolocalización.

Se establecerán dos tipos principales de experimentos. En el primero, se compararán 2 tipos de prácticas de gestión: tratamiento fungicida convencional (periódico), y tratamiento según el sistema de alerta de plagas. En el segundo, se probarán 3 tipos de tratamientos contra las malas hierbas: uso de herbicidas, labranza y uso de cultivos de cobertura (una mezcla de Vicia sativa, Avena sativa y Hordeum vulgar). Cada práctica de manejo se replicará 3 veces en subparcelas (100 m2) distribuidas al azar en las parcelas experimentales. En cada subparcela, se seguirán los parámetros relacionados con la producción del cultivo (ver WP7), la salud de las plantas (ver WP3) y el desarrollo de las malas hierbas (una por semana) durante todo el ciclo del cultivo y durante 3 ciclos de cultivo.

Además, se tomarán muestras de suelo en cada subparcela (6 por año) para los análisis de Cu, biodiversidad del suelo y servicios del ecosistema. En cada subparcela se tomarán 10 submuestras (0-20cm) que se mezclarán en una muestra compuesta (2-4 kg), se almacenarán en recipientes frescos y se transportarán al laboratorio. Además, las muestras para el análisis de la densidad aparente se tomarán en tres puntos de muestreo (método del anillo) hasta 20 cm de profundidad, y las lombrices de tierra se muestrearán también en 3 puntos mediante la clasificación manual (0-20 cm) y la expulsión química para las excavadoras profundas. Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo compuesto serán homogeneizadas a mano y divididas en diferentes partes. Una de ellas, de 500 gramos, se almacenará a 4ºC para el posterior análisis de la diversidad de nematodos. Una segunda, de 10 gramos, se congelará a -20ºC para los análisis de diversidad de bacterias y hongos. Una tercera de 25 gramos se almacenará a 4ºC para algunos análisis químicos. El resto de la tierra se secará a temperatura ambiente y se almacenará en tarros de polipropileno para los principales análisis físico-químicos.

El sistema de alerta de plagas se basará en el paradigma del Triángulo de la Enfermedad. El desarrollo de una infección y la consiguiente administración de un tratamiento sólo se llevarán a cabo cuando se den tres circunstancias al mismo tiempo: la viña en un estado fenológico sensible, la presencia de la plaga en el viñedo y la aparición de condiciones meteorológicas propicias para la infección.

La susceptibilidad de las vides a los atanques fúngicos varía entre los distintos estados fenológicos. Para el estudio de las fases fenológicas se seguirá la escala de Lorenz, adoptada por el BBCH como escala estandarizada para las observaciones fenológicas en la vid. En cada parcela experimental se seleccionarán al azar 20 plantas de cada variedad. Se realizará una visita por semana al viñedo a lo largo del año, aumentando dos veces por semana entre mayo y junio. Para una mejor determinación del momento óptimo de vendimia, se realizará un estudio de la evolución del Índice Brix (%) y de la Acidez Total (g/l de ácido tartárico) durante la fase fenológica 8 de maduración de las bayas. El inicio de las diferentes fases fenológicas se predecirá mediante modelos fenoclimáticos basados en los requerimientos de frío y calor para romper la latencia y el posterior inicio del ciclo reproductivo. Para la estimación de los requerimientos de frío se considerarán los métodos de Aron y Jato. La fecha de inicio del periodo de acumulación de frío se determinará a partir del momento en que las temperaturas medias diarias desciendan en otoño desde la temperatura umbral seleccionada. El final del periodo de acumulación de frío se considerará cuando la la temperatura media diaria registre valores mínimos y se observe un cambio en su tendencia. Para calcular las necesidades de calor se seguirán diferentes métodos. Nuestra base de datos previa junto con los 4 años de datos obtenidos con este proyecto nos permitirán desarrollar modelos fiables e incluso validar los modelos feno-climáticos para predecir los diferentes estados fenológicos a partir del último año de muestreo (no incluido para el desarrollo del modelo).

Para el estudio de la presencia de patógenos en el viñedo, se evaluará el muestreo de esporas en el aire de los principales hongos fitopatógenos mediante cuatro muestreadores volumétricos (Lanzoni VPPS-2010). Los muestreadores se colocarán en ambas zonas bioclimáticas, una en una zona no tratada del viñedo y otra en una zona tratada según el sistema de alerta de plagas. Las muestras se procesarán según la metodología propuesta por la Red Española de Aerobiología. Además, se cuantificarán semanalmente las lesiones en la planta siguiendo los métodos descritos por Zahavi et al. y Carisse et al., en 10 racimos de cada variedad desde el inicio del estadio 1 de desarrollo de la hoja hasta la fecha de vendimia. En cada planta se seleccionarán dos ramas laterales y en todas las hojas/racimos se estimará la severidad de las enfermedades en base al porcentaje de área afectada utilizando una escala de 0 a 4: 0 = 0% , 1 = 1-10%, 2 = 11-25%, 3 = 26-50% y 4 => 50%. Las investigaciones realizadas establecen una correlación significativa entre la concentración de esporas en el aire del viñedo y la densidad de las lesiones de la planta una semana después. Se pretende determinar los umbrales de riesgo de infección por esporas de cada patógeno comparando las concentraciones de biosensores como propágulos fúngicos en el aire con la manifestación morfológica de las enfermedades producidas en las parcelas de estudio.

Finalmente, se desarrollarán algoritmos basados en los datos meteorológicos registrados en los viñedos de cada zona bioclimática para identificar los eventos propicios de condiciones meteorológicas favorables para la infección fúngica. Se aplicarán diversas herramientas estadísticas como el análisis de regresión, las series temporales y las redes neuronales. Las estaciones meteorológicas de cada parcela en estudio medirán los parámetros cada 16 minutos. También se tendrán en cuenta varios índices meteorológicos de infección como los de Goidanich et al. o Magarey et al.

Una nueva metodología desarrollada recientemente por el grupo de investigación será validada para los suelos de los viñedos. Esta metodología se basa en la Tolerancia Comunitaria Inducida por Contaminación (PICT), el punto final es el crecimiento de la comunidad bacteriana del suelo y la técnica de incorporación de 3H Leucina. Con este propósito, se muestrearán y caracterizarán 30 muestras de suelo de viñedos con diferentes antecedentes de contaminación por Cu y diferentes características del suelo. Las muestras de suelo serán analizadas en cuanto a: textura (método internacional, utilizando la pipeta Robinson); pH en agua y KCl (1:2.5); carbono y nitrógeno total (autoanalizador CN); cationes intercambiables y capacidad de intercambio catiónico de los suelos; P disponible; Cu total (espectrofotometría de absorción atómica tras digestión por microondas); Cu biodisponible extraído con EDTA y determinado por espectrofotometría de absorción atómica.

Se estimará la tolerancia de la comunidad bacteriana al Cu (PICT) para las 30 muestras, lo que nos permitirá decidir cuáles de ellas están contaminadas desde el punto de vista de la comunidad bacteriana. Los resultados de la PICT también se compararán con las características generales analizadas previamente para detectar los suelos vulnerables a la contaminación por Cu en función de las características generales del suelo.

Las muestras contaminadas (detectadas con el análisis PICT) se someterán a técnicas de remediación basadas en la adición de subproductos al suelo (concha de mejillón triturada y corteza de pino). Las muestras de suelo contaminado se enmendarán con cinco dosis diferentes (6, 12, 24, 48 y 96 g kg-1) de corteza de pino y concha de mejillón, individualmente. También se utilizará una mezcla 1:1 de ambos subproductos con las mismas dosis. Tras 30 días de incubación al 80% de la capacidad de retención de agua, se evaluará la eficacia de estas técnicas de remediación mediante el PICT.

Se analizará la biodiversidad del suelo en cuanto a microorganismos y microfauna del suelo en los suelos del WP2 (540 muestras). Estos organismos del suelo son importantes bioindicadores complementarios en relación con el vínculo entre la biodiversidad del suelo y su funcionamiento. Se ha seleccionado un representante de cada grupo funcional del ecosistema del suelo: ingenieros químicos (bacterias y hongos), reguladores biológicos (nematodos) e ingenieros del ecosistema (lombrices).

Toda la diversidad microbiana se analizará utilizando ácidos grasos fosfolípidos (PLFAs) extraídos de los suelos. Brevemente, los lípidos se extraen del suelo con una mezcla de cloroformo: metanol:tampón de citrato (1:2:0,8 v/v/v) y se separan en lípidos neutros, glicolípidos y fosfolípidos utilizando una columna de sílice preempacada. Los fosfolípidos se someten a una metanólisis alcalina suave y los ésteres metílicos de ácidos grasos se identifican mediante cromatografía de gases (detector de ionización de llama) por los tiempos de retención relativos de los ácidos grasos, utilizando nondecanoato de metilo (19:0) como patrón interno. Los datos de concentración de todos los PLFAs individuales, expresados como valores relativos respecto a los PLFAs totales, se someterán a un análisis de componentes principales (PCA) para dilucidar las principales diferencias en los patrones de PLFAs.

La diversidad bacteriana y fúngica se analizará mediante la secuenciación de amplicones del gen ssu rRNA.

El ADN total de la comunidad microbiana se extraerá de las muestras de suelo utilizando el FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101, USA) según las instrucciones del fabricante. El ADN total se amplificará (qPCR) utilizando cebadores específicos para hongos (ITS2, ITS3, ITS4; ITS5) [44] y bacterias (F968, R1073, 8F, R361) [45-46]. La extracción de ADN y la secuenciación se realizarán en la Universidad de Vigo, mientras que la bioestadística (para la evaluación de la biodiversidad alfa y beta) se realizará en la Universidad de Copenhague, supervisada por Kristian Koefoed Brandt.

Las muestras de suelo para el análisis de la diversidad de nematodos se enviarán al Instituto de Investigación de Agricultura, Pesca y Alimentación de Flandes, donde serán manejadas por Lieven Waeyenberge. Los nematodos se extraerán de las muestras de suelo (centrifugación zonal), y el ADN se extraerá de la suspensión de nematodos obtenida según las instrucciones del fabricante del DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), a partir de ahora denominado «método Qiagen», con una adaptación. Para concentrar el ADN, la cantidad de tampón de elución se reduce a 75 μl en lugar de 200 μl. Una parte del gen 18S rRNA se amplificará (PCR) utilizando un conjunto de cebadores dirigidos a los nematodos (NemFopt y 18Sr2bRopt).

Por último, la identificación de la masa de lombrices y de las especies se realizará en colaboración con el profesor Stefan Schrader utilizando claves dicotómicas tradicionales, basadas en caracteres morfológicos.

Los parámetros relacionados con la fertilidad del suelo se medirán en las muestras de suelo recogidas en el paquete de trabajo 2. Llevaremos a cabo los siguientes análisis de suelo:

1. Nutrientes (N total, NH4+, NO3-, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, B, Mo)
2. Capacidad de intercambio catiónico y saturación de bases
3. pH y salinidad del suelo
4. Presencia de pesticidas totales

Seguiremos los protocolos descritos y seleccionados para el estudio LUCAS Topsoil Survey. Además, se evaluarán los parámetros relacionados con el secuestro de C en las muestras de suelo recogidas en el WP2. Para ello, se medirá el C orgánico total y las diferentes fracciones funcionales (activo, lento y pasivo), el C inorgánico y la textura.

El seguimiento de las emisiones de GEI (CO2 y N2O), la interpretación de los datos y el análisis de la variación entre las prácticas de gestión y las estaciones ayudarán a comprender los mecanismos de mitigación de los GEI. Se realizarán mediciones directas de campo en parcelas de suelo mediante mediciones periódicas de CO2 y N2O por el método de cámara estática y medición de la concentración de gases por Cromatografía de Gases. Alcanzaremos al menos 25 medidas de GEI al año, siempre a la misma hora.

Se desarrollarán modelos de predicción de cosecha en parcelas no tratadas y tratadas, mediante la aplicación de análisis de regresión estadística, series temporales y redes neuronales, para las variedades autóctonas más importantes en las zonas bioclimáticas estudiadas: Albariño y Godello en la Eurosiberiana y Treixadura y Godello en la Mediterránea.

Se evaluarán diferentes tipos de variables como estimadores del modelo:

• Aerobiológicas, como la concentración de las esporas fitopatógenas en el aire obtenidas a través del WP3
• Fitopatológicas, como la cuantificación de las lesiones obtenidas a través del WP3
• Fenoclimático considerando los requerimientos de frío y calor obtenidos a través del WP3
• Meteorológico, como los algoritmos que identifican los períodos propicios para la infección obtenidos a través del WP3
• La producción (polen/planta, polen/antera, anteras, flores, racimos de plantas) o la eficacia de la fecundación (índice de flores sueltas y viabilidad de los granos de polen)

La producción del número de granos de polen por teca, antera, flor, racimos y planta se evaluará para 10 cepas de cada una de las variedades estudiadas siguiendo el modelo propuesto por Cruden e Hidalgo. Se evaluará la cantidad de granos de polen por antera y la viabilidad de los mismos en tres racimos por cepa. En cada uno de ellos se recogerán tres flores y en cada flor tres anteras (27 anteras por planta). Las flores frescas próximas a la antesis serán muestreadas y transportadas al laboratorio en neveras portátiles. Las anteras se extraerán de cada flor y se depositarán en el fondo de un tubo de muestreo. A continuación, se añadirán 0,5 ml de agua destilada y se agitará el tubo. Con una micropipeta, se extraerán 10 ml y se colocarán en un portaobjetos para contar los granos de polen con un microscopio óptico. El recuento se repetirá tres veces para cada tubo. Se realizará un estudio de viabilidad con las mismas muestras utilizando el reactivo Alexander. Además, se contará el número de anteras por flor, de flores por racimo y de racimos por cepa para estimar la producción total de polen de cada variedad. Por último, para evaluar la eficacia de la fecundación se realizará un estudio de los botones florales no fecundados durante la floración en 10 cepas de cada una de ellas cuyos resultados se expresarán en porcentaje.

El desarrollo de los WP 2-6 dará lugar a la recogida de muchos datos con una pluralidad y complejidad que implicará necesariamente un esfuerzo compartido hacia su integración y valorización.

Se evaluará la interrelación entre la biodiversidad y el funcionamiento del suelo, los indicadores de cultivos, los indicadores de suelo y los datos de emisiones de GEI, dando información sobre cómo la biodiversidad del suelo está relacionada con la calidad del suelo, la resiliencia al estrés y la capacidad del agroecosistema para asegurar servicios ecosistémicos estables y eficientes como la productividad de las explotaciones, el control de enfermedades/plagas o la regulación del clima (secuestro de C, reducción de emisiones de GEI).

El WP7 se centra en determinar la identificación del mejor indicador de la riqueza de especies y los índices de uniformidad y diversidad de las comunidades microbianas e invertebradas y su integración y correlación con el conjunto de datos obtenidos a través de los diferentes WPs. Utilizaremos análisis estadísticos multivariados multifuncionales (RDA y CCA) y regresiones o modelos lineales para evaluar esta interrelación.

Ejecución, durante toda la vida del proyecto, de las actividades previstas en el Plan de comunicación, difusión e internacionalización de Susvinpro.